Isolement de classes de complémentation - CPY

Dans les dernier slides du chapitre sur le Golgi, il explique comment mettre en évidence des mutants déficients pour la voie de transport de la CPY vers la vacuole. Ça ok!...

Prenons l'exemple du mutant vps isolé à partir des leu2. On a donc créer un mutant leu2 auxotrophe pour la leucine et qui ne peut pas utiliser CBZ-phe-leu comme source de leucine car la CPY est dirigée vers la vacuole et non vers le périplasme.

Ensuite, on isole un mutant à nouveau capable de croître sur ce milieu et cela veut dire que la voie de transport de CPY est affectée par la mutation et que, par défaut, la protéine est excréter.

J'espère que jusqu'ici j'ai bon...

Comment on trouve des classes de complémentation à partir de tels résultats?

Comment il trouve la mutation ou le gène responsable de ce changement de comportement sur base de cela??

Perso, à partir des mutants non capables de croître sur le milieu j'aurais flanqué une banque de plasmides dans tout le bazard et j'aurais isolé le plasmide de celui qui pousse à nouveau sur le milieu... Pourquoi on ne fait pas ça?

En fait je crois que c'est pas tout à fait ça.

Au départ tes levures elles sont incapable d'utiliser le CBZ-phe-leu comme source de leucine pcq l'enzyme capable de dégrader ce composé n'est normalement pas excrété dans l'espace périplasmique.

L'idée c'est donc de faire de la mutagenèse sur des levures auxotrophes pour la leucine afin de provoquer chez elles un défaut de transport de l'enzyme vers la vacuole (qui sera alors dirigé vers l'espace périplasmique pour s'en débarasser j'imagine?). Tu les fais ensuite pousser sur un milieu possédant de la leucine (Jusque là pas de problème elles poussent).
Après tu fais un réplicat sur milieu + CBZ-phe-leu. Seuls les levures qui présentent un défaut dans le transport vers la vacuole pourront pousser. Et ces défauts peuvent être provoqués par des mutations à plusieurs niveaux (mutation sur les Rab, GEF, Snares, dynamine...) d’où les différentes classes de complémentations.

Après ce qu'il dit pas j'imagine, un peu comme tu dis, qu'il va tester par complémentation à partir d'une banque d'ADNc voir quel gène a été muté et l'identifier.

D'accord avec Nico, mais juste un détail :

Pretoriko a écrit:
L'idée c'est donc de faire de la mutagenèse sur des levures auxotrophes pour la leucine afin de provoquer chez elles un défaut de transport de l'enzyme vers la vacuole (qui sera alors dirigé vers l'espace périplasmique pour s'en débarasser j'imagine?).

Je pense que les molécules de la voie de sécrétion sont secrétées "par défaut" dans l'espace périplasmique, sauf si elles sont envoyées au lysosome (vacuole). Donc pas spécialement pour s'en débarasser, c'est juste la voie par défaut, si le signal Mannose-6-P n'est pas présent, ou qu'il y ait un disfonctionnement dans l'adressage au lysosome, comme c'est le cas ici.