Clonage du gène PHO

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Clonage du gène PHO

Message par Alex le Mar 22 Mai - 1:01

Comment ont fais, une fois qu'on a isolé les levure mutant qui ont bien complémentée avec le plasmide ajouté pour récupéré le plasmide et le mettre dans E coli ?
C'est la transition entre les deux. On prélève le plasmide dans le cytoplasme avec un seringue puis on le remet dans une E coli au hazard ?
Il dit qu'on l'extrait l'ADN et puis qu'on a une transformation de la bactérie E.coli... ?

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Berengere le Mar 22 Mai - 13:45

Normalement, tu disposes des plasmides à part, comme dans une bibliothèque si tu veux, et tu sais lequel tu ajoutes où (tu les mets pas tous en mélange dans un gros pot avec tes bactéries, tu répètes en fait l'expérience pour chaque plasmide!)..... donc après tu reprends le plasmide que tu veux de ta bibliothèque pour le mettre dans E.coli.

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Berengere le Mer 23 Mai - 23:42

J'avoue qu'en relisant mes notes, on parle de l'extraction de l'ADN.... pourtant, j'ai bien noté qu'on mettait une seule sorte de plasmide par culture... donc c'est vrai que c'est pas très clair. Peut-être poser la question à un/une biologiste, ils ont eu les tp, eux Smile

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Alex le Mer 23 Mai - 23:59

Zut j'aimais bien ton explication

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Berengere le Jeu 24 Mai - 0:00

oui, moi aussi Very Happy
J'ai posé la question à une biologiste, on verra bien si elle me répond.

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Alex le Mer 30 Mai - 0:14

Elle donné une réponse Smile ?

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Berengere le Mer 30 Mai - 11:33

Ah oui, désolée, j'ai oublié de transmettre, voilà sa réponse après que j'ai dit que je pensais que puisqu'on savait quel plasmide on mettait où, je ne comprenais pas bien pourquoi l'étape de purification de l'ADN...:

"Ouais, j'ai pensé à la même chose, je me suis dit "Encore un qui foire ses étiquettages"
Plus sérieusement, je crois que c'est à cause de possibles mutations qui peuvent appraître entre le moment où t'insères l'ADN et le moment où ça complémente (ces braves bestioles ont quand même des mécanismes de survie face à l'invasion d'ADN exogène)

Bon, alors, extraction et purification de l'ADN, à la bourine

- tu fais une extraction type phénol-chloroforme sur ta cellule (oui, elle va mourir...)
-purification : tu fais une migration sur gel d'agarose, tu découpes le produit dont le poids correspond à ton plasmide
- tu le débarasses de son agarose (agarase, colonne de silice à rétention d'ADN,...)
-Transformation des bactéries : l'étape marrante. Tes plasmides purifiés et hydrophiles doivent traverser une bicouche lipidique. Soit, tu utilises des agents chimiques très chers qui forment des liposomes avec ton ADN et viennent ensuite se souder à la membrane plasmique. Soit, tu électropores = courant électrique et petits trous dans la membrane. JE te laisse deviner où le taux de survie est le plus élevé...

Avec tout ça, je vois pas trop l'intérêt de mettre ces plasmides dans les bactéries... "

Voilà, sans édition ni rien.... j'espère que ça t'aide Smile

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Boris le Mer 30 Mai - 15:15

j'ai justement été demander ça au prof pendant le cours parce que je comprenais pas non plus pourquoi on utilisait les bactéries et il m'a dit qu'on n'avait pas une culture par plasmide, mais on met des milliers de plasmides en même temps (sinon ça prendrait trop de temps). on utilise les bactéries pour amplifier le plasmide qui s'est inséré et après purification etc.. on peut définir de quel plasmide il s'agit.

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Re: Clonage du gène PHO

Message par Berengere le Mer 30 Mai - 16:32

ah ok.... parce qu'en biomol, Gueydan avait justement bien expliqué qu'on avait des bibliothèques de plasmides et qu'on en mettait qu'un à la fois pour justement savoir quoi Razz Ils pourraient se mettre d'accord je trouve.... soit!
Je transmets aux biologistes alors.... et merc! Smile

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Re: Clonage du gène PHO

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