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vecteurs plasmidique x-gal et coloration

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Message par Fred 2703 Jeu 13 Déc - 14:08

Pour vérifier si un plasmide contient bien l'adn étranger, on utilise un deuxième marqueur : enzyme galactosidase (gène lacZ).
On place le tout sur un substrat x-gal. Si le gène de l'enzyme est exprimé, on obtient une coloration bleu pour la colonie.
J'ai écrit qu'on insérait l'adn étranger dans la zone polylinker du gène lacZ et que si la colonie était blanche (donc non expression du gène lacZ), c'est que l'adn étranger c'était inséré dedans et qu'on avait donc notre recombinant. est ce que c'est correct ?

je viens d'arriver sur la partie avec le système d'expression eucaryote des insectes et j'ai l'impression qu'on dit le contraire. Quelqu'un peut m'éclairer sur cette partie ?
Fred 2703
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Message par Annabelle Dim 23 Déc - 12:37

On sait que la galactosidase va cliver le x-gal (incolore) en x (coloré) et galactose (incolore).
Si la portion d'ADN étranger est bien insérée, la galactosidase ne sera pas active --> le x-gal ne sera pas clivé en x et galactose.

DONC
> Si on voit des colonies avec une colo bleue, c'est que galactosidase est active --> que l'ADN étranger n’a pas été inséré.
> Si on observe des colonies avec une colo blanche, c'est que la galactosidase n'est pas active --> que la portion d'ADN étrangere a bien été insérée.

donc j'ai la même chose que toi Surprised
par contre je ne suis pas encore arrivée aux insectes Razz
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Message par ben Dim 23 Déc - 15:30

Pour les insectes, si j'ai bien compris :

Tu as un premier plasmide dans lequel tu met ton gène d'intérêt, et un morceau du gène lacZ (il n'est pas en entier).
Tu as un deuxième plasmique, qui contient l'autre partie du gène lacZ.
Tu fou tout dans ta cellule d'insecte (--> co-transfection) et dans cette cellule, tu vas avoir recombinaison entre les deux plasmiques.

Si tu as une recombinaison, les deux fragments des lacZ se retrouvent ensemble, et donc la B-galactosidase est exprimée, et donc le X-Gal est clivé, donnant la couleur bleue à la plage.
Si pas de recombinaison, les deux parties de lacZ sont séparées, et ne peuvent donc pas produire une enzyme correcte. Ca reste donc blanc.
ben
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