cours2 - slide 15

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Message par sebastien le Ven 13 Jan - 22:04


Elle montre quoi cette expérience???

sebastien
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Re: cours2 - slide 15

Message par sebastien le Ven 13 Jan - 22:12

je me réponds moi même... regarde dans les notes de cours et tu trouveras ça... :

XP simple basée sur utilisation d’un système proche de celui du gène rapporteur. On utilise la -galactosidase (elle est beaucoup utilisée car on peut repérer facilement son activité ; en effet, elle hydrolyse le lactose, et on a dans les labo un composé appelé Xgal qui est un analogue du lactose et qui, lorsqu’il est métabolisé par la -galactosidase, donne une coloration bleue).

(a) Pour mettre en évidence la réponse aux glucocorticoïdes, la séquence qui code pour la -galactosidase a été placée sur un plasmide, et celui-ci a été transfecté dans des cellules eucaryotes. Puis, si on fixe cette cellule à un moment donnée de la culture en présence de Xgal, on peut obtenir une coloration bleue (repérée sur photos) : si on voit du bleu, c’est que le plasmide a été transfecté dans les cellules, la -galactosidase a été produite. On voit aussi que ça colore surtout le cytoplasme des cellules car la -galactosidase est produite au niveau cytoplasmique et elle n’est pas capable de passer dans le noyau.

(b) Maintenant, on fait la même XP mais le plasmide qu’on trasnfecte contient une fusion de la séquence qui code pour la -galactosidase avec celle du récepteur aux glucocorticoïdes  on a donc une protéine hybride qui va avoir 2 types de fonctions : l’activité enzymatique de la -galactosidase et l’activité du récepteur aux glucocorticoïdes. On fait l’XP sur des cellules qui n’ont pas été traitées par des hormones : on observe que la fusion permet toujours de repérer l’activité de la -galactosidase c’est un contrôle positif sur l’XP càd que c’est pour s’assurer que le fait de modifier la protéine -galactosidase en lui fusionnant quelque chose à son extrémité permet toujours de repérer son activité.
Ce qui est intéressant : si on traîte les cellules avec la Dexabetazol( ?) (un analogue du cortisol capable de se fixer aux récepteurs aux glucocorticoïdes), la coloration qui résulte de l’activité de la -galactosidase est nettement relocalisée dans le noyau  Cela indique qu’en réponse à un traitement par hormone, le récepteur est relocalisé dans le noyau.
 Au départ le récepteur est inactif car il est localisé dans le cytoplasme et la fixation du ligand lui permet d’être relocalisé dans le noyau, ce qui va le rendre actif.

(c) En complément, on peut montrer qu’une protéine de fusion qui ne contient que l’élément de fixation du ligand (càd l’élément de reconnaissance de l’hormone), avec la -galactosidase, donne le même type d’image  cet élément de fixation des glucocorticoïdes est à lui seul nécessaire et suffisant pour obtenir la relocalisation de l’hormone. Les autres éléments (l’élément activateur et celui de fixation à l’ADN) ne sont pas impliqués dans le transit entre le noyau et le cytoplasme. En présence de cet élément + l’hormone, la protéine peut devenir nucléaire, et c’est lorsque elle est nucléaire qu’elle va fixer l’ADN.

Donc la régulation est basée uniquement sur une régulation de la localisation.



sebastien
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