Chromosome walking

Voila, je ne comprends rien au chromosome walking. Enfin, un peu quand même grâce à cette définition:
"méthode permettant d'établir par approches successives la séquence d'un fragment de chromosome en s'appuyant sur une séquence nucléique connue afin d'établir la séquence des région nucléiques voisines et chevauchantes."
Mais y a-t-il autre chose à comprendre??
Meurrrchi

Et bien c'est un peu le complémentaire de la méthode de Sanger...Vu que cette dernière est limitée à un séquençage de qqs 1000 paires de bases, le chromosome walking te permet de séquencer des séquences plus grandes.

Le principe est de progresser petit à petit sur le brin en faisant chaque fois des séquençages de Sanger pour 1000 pb. A la paire 1001, tu met une nouvelle amorce et tu séquence denouveau 1000 pb. Le problème c'est que tu dois attendre que le premier séquençage soit fini pour entamer le suivant...

C'est plus clair?

oui
Et une explication pour le shutgun???

Haha tout de suite un peu plus long :p
Enfin non la méthode est hyper rapide justement, là est l'intérêt de la méthode^^

Le principe c'est de fragmenter ton génome en plein de petites séquences d'environ 100 pb (le génome a préalablement été multiplié mais je sais pas encore pourquoi --> pour diminuer les risques d'erreur peut être?).

La fragmentation est fait au hasard, juste dans le but d'avoir plein de petites séquences que tu peut séquencer en même temps --> Là est l'intérêt.

Par contre, on rencontre deux problèmes:

1) Il faut trouver une amorce commune pour chaque tous ces fragments aléatoires (pcq on en a pas un spécifique pour chaque fragment c'est trop compliqué).

Solution: On incorpore chaque fragments dans un même type de plasmide avec la même enzyme de restriction et on donc la même amorce à chaque fois. On réplique ces plasmides pour récupérer ces amorces.

2) Le génome humain contient énormément de séquences répétés (environ 50%), plusieurs fragments contiennent donc la même séquence et on ne sait plus els différencier...

Solution: C'est une technique hybride qui consiste à découper le génome en morceaux plus grands d'abors, qu'on réorganise en fonction de leur recouvrement (on séquence juste le bord des séquences pour les aligner).
Ensuite, chacun des grands morceaux est isolé et séquencé par "shotgun séquencing" --> on a diminué les chance de s'embrouiller dans l'ordre des fragments en les alignant préalablement

Tadaaaaam

cool merci beaucoup, pcq entre mes notes et les shemas des slides je my retrouvais plus trop <3 <3

marieke a écrit:
Le principe c'est de fragmenter ton génome en plein de petites séquences d'environ 100 pb (le génome a préalablement été multiplié mais je sais pas encore pourquoi --> pour diminuer les risques d'erreur peut être?).

Parce que tu casses tout, tu séquences en vrac, mais tu dois remettre tout dans l'ordre. Pour cela, il faut faire plusieurs fois la manip', casser à des endroits différents, et puis un bon gros ordinateur bien puissant remet tout dans l'ordre. Mais pour cela, il est indispensable d'avoir fait plusieurs fois la séquence, pour qu'il y ait des recouvrements.

Exemple (ça aide toujours ):

Tu as AATTCGAACG, tu veux séquencer en le cassant, imaginons que ça donne:
AATTC et GAACG, tu trouves ça, mais tu sais pas lequel était devant l'autre dans le génome.

Donc tu fais ça plusieurs fois, tu as au final:
(AATTC et GAACG), (AATTCGA et ACG), (AAT et TCGAACG), ben là tu peux le remettre assez facilement dans l'ordre.
Quand t'as quelques milliers de fragments, c'est plus dur...

Et c'est justement à cause de ça que pour le génome humain, ça marche pas. Il y a trop de répétitions inutiles --> même avec des superpositions, c'est super dur à remettre dans l'ordre. Donc là on découpe des grops morceaux et on fait le shotgun dans ceux là.

Au moins on sait tout maintenant :p

marieke a écrit:

Solution: C'est une technique hybride qui consiste à découper le génome en morceaux plus grands d'abors, qu'on réorganise en fonction de leur recouvrement (on séquence juste le bord des séquences pour les aligner).
Ensuite, chacun des grands morceaux est isolé et séquencé par "shotgun séquencing" --> on a diminué les chance de s'embrouiller dans l'ordre des fragments en les alignant préalablement

Tadaaaaam

Je ne pense pas qu'on séquence le bord des gros d'abord ca me parait bizarre a faire (voir impossible?), j'ai plus l'impression qu'on séquence d'abord les petits morceaux et que chaque groupe de petits morceaux nous donne un des grands morceaux, et donc forcément ses bord avec (je pense ^^), et la tu peux faire recouvrir les grands

sorry de te contredire mais moi aussi j'ai noté qu'on séquencait d'abord le bord des gros morceaux avec sanger avant de les découper en petits avec shot gun

0.0 si c'est le prof qui le dit! Mais je ne vois toujours pas comment c'est possible ^^